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下一代分子诊断技术的觉醒

时间: 2021-06-09 来源:生物网
  自动化高通量测序系统对生命科学研究产生了不可磨灭的影响。他们现在正准备创新分子诊断技术。

  CRISPR和下一代测序技术正在彻底改变从传染病到早期癌症检测的分子诊断。这项科学可能会导致什么?

  CRISPR基因编辑和下一代测序(NGS)技术彻底改变了临床和生命科学研究模式。CRISPR允许选择性靶向和编辑特定的核苷酸序列,其准确性和易操作性在几年前是无法实现的。NGS可以实现高通量,准确和负担得起的脱氧核糖核酸或核糖核酸测序。

  这些技术共同推动了基础分子和细胞生物学以及疾病研究的诸多进展,CRISPR的发现甚至为其背后的研究者赢得了2020年的诺贝尔奖。他们还帮助开发新的基因和癌症治疗方法,如汽车T细胞。

  虽然这些成就得到了广泛认可,但CRISPR和NGS可能对分子诊断产生了同样深远的影响。基于CRISPR和NGS的一些诊断方法已经进入临床实践,但正在开发的应用数量要大得多。这些诊断方法可以在许多领域实现疾病的早期检测、准确的疾病监测和更灵活的精确治疗管理。

  就像早期的免疫吸附分析或荧光原位杂交一样,CRISPR和NGS为开发分子诊断的人提供了重要的机会。这门科学在哪里,它可能导致什么?

  2016年,美国寨卡病毒的爆发,为第一例获得批准的CRISPR诊断创造了条件。从那时起,CRISPR诊断已被用于检测拉沙病毒和埃博拉病毒,以及新型冠状病毒。迄今为止,传染病的爆发促进了技术的发展。然而,任何需要对已知基因靶标具有高选择性的环境,如肿瘤样本分析、遗传变异体鉴定或无创性产前检测(NIPT),都可能是CRISPR诊断的候选对象。

  CRISPR是最著名的基因编辑系统,其中Cas9蛋白被设计成与导向RNA配对,然后与靶DNA互补结合。目标DNA鉴定出来后,Cas9会在某个位置切割序列,允许基因缺失或插入。

  基于CRISPR的诊断背后的机制类似于基因编辑,因为它使用了一个设计好的指导RNA。但它通常使用不同的Cas蛋白,即Cas  12、Cas  13和Cas  14。这些蛋白质可以被修饰,以在靶核苷酸序列(DNA或RNA)存在的情况下产生荧光信号,使该系统适用于检测或成像。尽管大多数研究人员正在开发他们自己的CRISPR诊断方法,但最近出现了两个商业平台来加速这一过程。夏洛克是由布罗德研究所的张峰团队开发的。而DETECTR是由加州大学伯克利分校的Jennifer  Doudna和她的团队创建的(Doudna因发现CRISPR-Cas9而获得诺贝尔奖)。这两个平台都使用CRISPR来为体外快速鉴定靶序列提供阿托摩尔灵敏度。

  和任何分子诊断一样,CRISPR试验需要足够的靶DNA进行检测。因此,它们通常依赖于检测前的扩增步骤。这通常通过聚合酶链反应(PCR)来完成,这是一种高保真的方法,需要热循环仪来扩增核苷酸序列。与真正的基于PCR的诊断方法不同,如逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),CRISPR诊断也可以使用其他扩增方法,这是一个优势。

  Thermo  Fisher  Scientific的Thermo  Fisher  Scientific的基因组编辑产品经理Matthew  Poling说,当临床医生开始考虑在他们的办公室或现场做这件事时,他们没有热循环仪。为了使这些诊断方法进入以病人为中心的即时护理,LAMP越来越有前景。

  LAMP或环介导等温扩增是一种新技术,可以在恒温下扩增核苷酸序列。与聚合酶链反应中通过加热分离双链脱氧核糖核酸不同,LAMP需要一种脱氧核糖核酸聚合酶,如EquiPhi29或BSM脱氧核糖核酸聚合酶,来主动“旋转”和扩增双链脱氧核糖核酸。这种技术也可以用来检测RNA序列。

  除了CRISPR试剂,Thermo  Fisher  Scientific  Shier  Technology公司还提供各种LAMP聚合酶作为冻干兼容酶。这些冻干酶不含甘油,在运输和储存过程中保持稳定,使它们更适合在野外或医疗点使用。

  肿瘤学是可能受益于CRISPR诊断的最大临床领域。虽然不可能走进医生办公室要求进行CRISPR测试,但研究人员正在做这项工作。在一个经过原理验证的实验室里,科学家们使用夏洛克平台来检测已知的癌症突变。其他研究人员正在采取不同的方法。Harveer  Dev是英国剑桥癌症研究中心早期检测项目的临床讲师和领导者,目前致力于分析和识别前列腺癌的常见生物标志物。他正在开发一个基于CRISPR的平台ProCASP,该平台可以绘制单个肿瘤的遗传变异图,以帮助预测它们对某些药物的敏感性。

  戴夫说,其目的是绘制特定基因在个体患者肿瘤中的功能。他希望自己的工作最终转化为诊断,为患者的治疗方案提供参考。

  如果有另一层信息需要补充,戴夫认为为不同的患者创造具体的治疗方法将非常重要。

  在癌症和其他疾病中,CRISPR诊断仍然面临挑战。例如,当前的CRISPR诊断不能用于高通量环境。此外,所有基于CRISPR的诊断平台都需要单一的已知靶序列,这在一些癌症和其他多因素遗传性疾病中可能特别具有挑战性。在CRISPR工具可以同时应用于多个基因之前,需要这种复用类型的诊断可能更适合于下一代测序工具。

  像CRISPR一样,下一代测序技术已经从标准的研究应用程序快速发展到复杂的诊断工具。

  立陶宛维尔纽斯热电费希尔科技公司的R&D经理安娜卡普斯蒂纳说,当NGS变得负担得起时,它实现了无假设实验,研究人员不需要知道他们在寻找什么。

  如今,快速并行测序使研究人员能够发现未知的遗传变异,例如检测罕见的疾病或一次筛选出一组可能的遗传变异。这种方法已成为肿瘤学的基础,即开发液体活检或精密疗法进行辅助诊断,并正在研究和应用于遗传性听力和视力丧失、遗传性心肌病和常染色体显性多囊肾的诊断。NGS还可以实现单细胞测序,这使得在单细胞水平上寻找生物标志物成为可能。

  在这一点上,NGS的技术非常成熟,但研究人员仍然面临一些持续的挑战。其中之一就是图书馆准备。在任何NGS筛查中,研究人员首先将样本DNA分成小片段,并标记它们以便于识别。然后对这些片段进行测序并分析结果。这可能是一个耗时的过程。

  不幸的是,卡普斯蒂纳说,他们不能跳过图书馆的准备工作,但他们正在努力使这些工作流程尽可能简单方便。Thermo  Fisher  Scientific  Schell提供一系列标准化试剂,支持Ion  Torrent和Illumina测序仪的文库制备,还为开发特定诊断的研究人员提供专家指导服务。研究人员面临的另一个挑战是样本的稳定性。维尔纽斯热电费希尔科学公司的产品经理sigita  Inst说,这对使用液体处理器或机器人系统的人来说非常重要,因为他们[添加样本并]将它们放置一段时间,甚至几天。热电费希尔科学公司积极咨询研究人员,帮助他们建立考虑到这些因素的工作流程和诊断方法。

  适合分子诊断的技术不是很常见。几十年来,分子诊断市场仍以聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验为主导。CRISPR和NGS诊断项目的发展为扩大这种结合提供了难得的机会。

  事实证明,这两种技术易于适应和扩展,允许快速开发和测试候选诊断,并且成本相对较低,使其更容易被保险公司和卫生系统接受。它们也可以相互补充,NGS可以用来识别未知的变异或同时筛选几个已知的生物标志物,单细胞测序CRISPR诊断适用于现场或医疗点。

  CRISPR和NGS诊断不太可能取代更成熟的方法。相反,几乎可以肯定的是,它们将扩展目前不可用的不同类型的诊断信息。就戴夫而言,他一直在使用各种工具诊断前列腺癌。

  Dev说,不管最终依靠什么诊断工具,都会是多模态的,这些工具不能孤立存在。

  这对那些追求分子诊断的人来说是个好消息,对CRISPR和NGS在农业或生物燃料方面的进一步应用发展来说也是个好消息。但最重要的是,这对病人来说是个好消息。
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